一、 实验准备
器材
液氮冷冻灌、 恒温培养箱、 电冰箱、高压灭菌锅、
磁力搅拌器、
离心机、 分析天平、倒置显微镜、 超净工作台、弯头吸管（1个）、胶头滴管（9个）、 离心管（9个）、 带塞培养瓶（不定个）、 试管架、 量桶、 烧杯、酒精灯、 抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶，大三角瓶 、无菌冻存管、液氮瓶
（一）、器皿
1玻璃器皿的清洗灭菌：
种类：小玻璃瓶、弯头吸管、滴管（3个）、培养瓶、量桶、 烧杯、抽滤瓶、大三角瓶，细菌过滤器接口管
药品：5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml
（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。
（
镜头一：实验人员将器皿放进加有5％盐酸溶液的盆内，并以字幕和配音的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的）
（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干
（
镜头二：实验人员刷洗器皿，使用正规的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3种即可，实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法）
（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。
（镜头三：带好橡胶手套将清洁液加入到盆中，让后进行酸浸，并以字幕的形式显示浸泡时间）
（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次
将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。
（
镜头四：自来水冲洗，蒸馏水清洗，烘干一起完成，在这个过程中可在装器皿的盘中放入一定量的玻璃器皿，只对其中一种进行自来水冲洗、蒸馏水清洗，洗好后就将所有仪器放入烘干箱中烘干，并在每一个步骤中以字幕或语音的形式显示相关操作次数和时间）
（5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
（
镜头五：实验人员对实验器皿中的1—2种进行包装示范，然后将其他包装过的器皿一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌）
（实验人员必须示范操作高压灭菌锅和恒温干燥箱的用法，示范操作步骤，只示范一次即可，在下面的不同灭菌温度和不同灭菌时间可以字幕的形式显示）
2、橡胶制品清洗消毒
种类：玻璃瓶橡胶塞、培养瓶瓶塞、皮管、滴管头
新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用
（镜头：0.5mol/L NaOH煮沸，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟各一个镜头，因为在上面已经示范过干燥箱和灭菌锅的操作方法，在使用干燥箱和高压灭菌时只需以字幕的形式显示烘干温度、灭菌温度、灭菌时间即可）
3、塑料制品的清洗消毒
种类：瓶盖、离心管
塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。
清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。
（因在器皿的准备过程中玻璃制品是**主要的，故塑料制品的清洗和消毒灭菌的方法可用字幕的方法显示出来）
（注意：各种不同材质器具的不同灭菌时间？温度设置？）
2、试剂准备
试剂 ：RPMI l640培养液, 小牛血清（生长因子）, 胰蛋白酶液，75%乙醇（消毒）,冻存培养液（培养液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS缓冲液等。
重点配置的药品：RPMI l640培养液、0.2%胰蛋白酶液。
药品：RPMI l640 培养粉、双蒸水、HEPES、碳酸氢钠、青霉素、链霉素；typsin粉末。
器材：大三角瓶、移液枪及枪头、无菌EP管、无菌室、无菌操作台、
磁力搅拌器、G6型号细菌过滤漏斗、细菌过滤漏斗、冰箱。
（1）
RPMI l640基础培养液的配制 ：
称取RPMI l640 培养粉 10.4g溶于1,000 mL双蒸水中,
磁力搅拌器搅拌40min. 加HEPES 2、4g。搅拌十分钟，2g碳酸氢钠 搅拌十分钟 。过滤前要加双抗 加入双抗****终浓度为 100单位/mL。过滤
经G6型号细菌过滤漏斗抽滤后备用
1、取RPMI l640培养粉10.4g，加入1L双蒸水于磁力搅拌器下搅拌40min
2、加入HEPES 2、4g，再次搅拌溶解10min，再加入2g碳酸氢钠，搅拌十分钟（每一步一个镜头一个配音说明即可，每一步骤6s左右时间）#p#分页标题#e#
3、无菌实验室打开紫外灯，紫外灭菌30min（可配音说明，6s左右）
4、人工消毒准备，无菌操作台酒精擦拭灭菌
（
镜头：实验人员穿上无菌实验室操作服用戴上橡胶手套，然后就位用酒精棉球消毒试验台）
5、将灭过菌的细菌过滤器进行组装
（
镜头：细菌过滤器的灭菌时间和灭菌温度可以配音或字幕的形式显示）
6、在无菌工作台上在培养基中加入双抗，并混匀，配成各100单位/ml双抗，混合后经行细菌过滤器过滤，并示范操作
7、将灭过菌的小玻璃瓶于试验台上解封，取下封口纸，将小玻璃瓶瓶口于酒精灯上过火，分装培养基，装好后再次过火，用过火后的橡胶塞塞紧，并编号，写上配置时间和配置人（每瓶90ml，只示范一个即可）
8、将封装好的培养液放入4℃冰箱中存放备用。
（在这几个步骤中每一步均以10s左右的视频时间演示，再加上培养，然后切入下一个步骤）
（2）胰酶的配制： 称取适量typsin粉末配制成0.1%--0.25%的浓度（0.006gtypsin粉末+3ml 双蒸水），配制时要使用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液（如D-hank's溶液），因为这些物质都会对胰酶产生抑制作用，胰酶无菌过滤时胰酶量多不锈钢过滤，量少时用抽提过滤 。
二 、实验台准备，实验人员就位
消毒剂:操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用碘酒、酒精消毒。无菌室内桌椅和物体的消毒可用过氧乙酸、来苏儿等擦拭或浸泡。
紫外线：主要用于消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。
（
镜头：在紫外线灯照射下的超净工作台和实验室一个镜头）
三 、复苏细胞
原理：冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。
材料：冻存的Hela细胞
器材：带塞培养瓶、离心管（3只）、胶头滴管（3只）、1ml移液枪、1ml移液枪头、烧杯、酒精灯、试管架、
离心机、无菌操作台、恒温培养箱
药品：RPMI l640培养液、小牛血清、酒精
镜头一：细胞解冻与活化（每一步为一个镜头）
实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台
（1）取一离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液。
（2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入36℃～37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。
（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中。
（4）低速离心(1200r／min) 6min，去上清后再用5--9ml培养液再清洗离心一次。
镜头二：装瓶培养
（1）离心后去掉上清液，在离心管中滴加内滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀。#p#分页标题#e#
（2）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴小牛血清（是小牛血清为10%的浓度），盖上瓶盖，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。
四、
传代培养及其操作步骤
原理：细胞在体外培养时，为使其生长状况与其在体内生长状况相似，必须在体外模拟体内生长的环境条件。一是提供细胞存活的必须条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其他相关的生长因子，还需要氧气、适宜的温度、适宜的酸碱度、适宜的渗透压，动物细胞还要加入适宜的血清。
当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的**大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。
材料：培养瓶中处于对数期的Hela细胞
器材：带塞培养瓶2—3个、离心管（3只）、胶头滴管（3只）、弯头滴管、1ml移液枪、1ml移液枪头、烧杯、酒精灯、试管架、
离心机、无菌操作台、恒温培养箱、倒置显微镜
药品：RPMI l640培养液、0.2%胰蛋白酶液、小牛血清、酒精
镜头一：制细胞悬液
（1）试验台的消毒工作准备好，尽量吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。
（此处消毒同上，消毒步骤可省略不拍，以配音的方式说明在实验前已进行试验台的消毒，关于细胞培养的换液再次可以做一个说明示范）
（2）向瓶内加入胰蛋白酶液1ml，置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。
（4）吸出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量，轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再少量含血清的加培养液（要加多少？）。
（5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。
（6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1200r／min) 6min
注意事项：
掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不易从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液5--9ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。
掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时间应缩短，过低时细胞消化时间相对延长。
镜头二：细胞分装
（1）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。
（2）取3个无菌培养瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精灯下过火消毒。
（3）在培养瓶中各加入1ml细胞悬液、2ml培养液（用移液枪）、15滴小牛血清，加好后酒精灯下过火加塞。
细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。
五 、培养细胞的冻存
原理：细胞的冻存**常用的方法是液氮冷冻保存法，主要是加入适量的保护剂缓慢的冷冻细胞。由于细胞在不加任何保护剂的情况之下，细胞内外水分会很快结成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度升高，PH值改变，部分蛋白质因此变性使细胞内部结构紊乱，溶酶体膜被破坏而放出大量酶将细胞内部结构破坏。因此在细胞冻存时的关键是尽可能减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成，故冻存时采用甘油或DMSO做保护剂，这两种物质分子量较小，溶解度大，易穿透细胞，可使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，对细胞毒害作用小，梯度慢速冷冻可使细胞内水分渗出细胞外，减少形成冰晶对细胞产生的伤害。
细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-196℃液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。
材料：培养瓶中处于对数期的Hela细胞
器材：带塞培养瓶2—3个、离心管（3只）、无菌冻存管、胶头滴管（3只）、弯头滴管、1ml移液枪、1ml移液枪头、烧杯、酒精灯、试管架、离心机、无菌操作台、恒温培养箱、倒置显微镜、冰箱
药品：RPMI l640培养液、0.2%胰蛋白酶液、10%DMSO、小牛血清、酒精、液氮瓶
镜头一：细胞悬液的制作
（1）选对数增生期细胞(细胞铺满度为90%左右时)，在冻存前1d换液。
（2）试验台的消毒工作准备好，吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。
（3）向瓶内加入1ml 0.25%胰蛋白酶液，以能覆盖培养瓶底为宜。
（4）置37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，2--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。
（5）吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培养液+15滴小牛血清，终止消化。#p#分页标题#e#
（6）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞，按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达左右密度
（7）将培养瓶中的细胞悬液转移到15ml离心管中，(1200r／min) 6min，去掉上清液。
镜头二：冻存
（1）配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液（培养液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml），于离心管中加入1ml冻存液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，一个培养瓶中的细胞只加入一个冻存管。
（2）将细胞悬液分装入无菌冻存管中，每管1～1.5 ml（冻存液要先预冷到4℃ ）；在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。
（3）冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增**-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入液氮气中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。
操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。
