关于细胞培养

贴壁细胞消化传代时通常采用两种方法：一、加入胰酶等细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；二、加入胰酶后，镜下观察待细胞始脱落时，弃胰酶，加培养液分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的细胞先脱落，对肿瘤细胞来说，这部分细胞有可能是恶性程度较高的细胞亚群。
      介绍一种简单的消化传代方法和各位共享。加入PBS洗去血清或加入胰酶先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将细胞消化单细胞。
1、洗去血清
2、加1/5V PBS/D-Hank‘s，2到3次
3、1/10V 胰酶
4、镜下观察，见突起缩回（细胞间隙增大）即加含血清培液
5、吹打后（加培液）
6、分种
      对于较难消化的细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打也可以，对细胞的影响不大。
1、弃去旧培养液，PBS或D液清洗2－3遍（除去旧培养液中血清的影响）；
2、加入0.125% (0.25%也可以) 胰酶6滴（25cm2的培养瓶），使胰酶刚刚可以布满整个底；
3、作用1min左右,用含10%血清的培养液3-5ml中和；
4、轻柔吹打细胞脱壁, 离心。
       赞同不用PBS也不用Hanks洗，只要把旧培养液吸的干净一点，直接加酶消化应该不会有什么问题。
对付难消化细胞的做法是弃取培养液后，用0.04%的EDTA冲洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min，弃取大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶（预热）总体积1/10v。消化到有细胞脱落。不过有人说EDTA对细胞不好。
        EDTA对细胞有损伤作用，一般在难消化的细胞才和胰酶合用，用了EDTA后把细胞离心后洗几遍洗去EDTA。
shou先，EDTA对细胞肯定有伤害，EDTA可以与细胞膜上很多大分子蛋白上的中金属成分发生螯合，致使蛋白变性影响蛋白质的生物活性而发生损伤。
       但是，这种损伤是可逆的。就细胞传代所用的浓度和时间条件下，还不致对细胞产生过大影响。其实Hyclone的胰酶中就有EDTA。
       因此在一般细胞操作中不能用TE代替PBS洗细胞。
       如果EDTA对细胞的伤害不是可逆的，想象一下，过去重金属中毒时用EDTA解毒岂不是又喝了一种毒药！
培养的BASMC：倒掉旧培养液，加入少量胰酶冲一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入适量新培养基中和，并分瓶 这种方法简单、省事；效果很好并且不损失细胞！
问题1：
       我的细胞消化要用EDTA加胰酶消化20分钟，有什么好办法？
解答1：
       先用PBS把细胞洗两遍，使瓶内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在细胞有些消化下来时，拿着瓶口，运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体，这样细胞很快就下来了，还不需要吹打，分散也均匀


问题2：
       消化细胞后都用什么洗涤呀？带血清的PBS，还是直接用PBS，或者是用培养液呀？我原代培养的细胞二次接种后总是有些细胞铺不开，有些又铺很好，不知是什么问题，求教一下
解答2：
       不管是进口血清或是G产血清，都用PBS直接冲洗三次即可，没有必要用DMEM或加血清的培养液。见意你查查胰酶消化的原理，本论坛中就有，加了血清胰酶怎么消化呀。
       

       细胞铺不开，原因有二：一是消化时离心管中的细胞没有吹打开，解决方法是离心后的细胞加3ml左右的培养基，用吸管轻轻吹打，吹打开后，再加培养基，这样细胞不会成团，培养基太多，细胞不容易吹打开。二是接种时，培养瓶中先加培养基，再接种细胞，接种后轻轻晃动摇匀。先加细胞后加培养基或不晃动摇匀，其结果就是细胞铺不开。
       养MSCs，传代时候胰酶消化过后，用加血清的培养液终止消化，再离心。弃上清夜，再加入含血清培养液，重悬浮细胞，吹打均匀，计数，安所需密度接种。先用少量培养液，比如1到2ml，润湿培养瓶，然后再接种细胞原因是如果直接接种细胞的话，肯定有的地方接触了较多培养液，而有的地方几乎就没有培养液，细胞当然不会在没有营养的地方待着了。
       总之，先用少量培养液润湿应该是一个解决办法。
我们的观点为：
1、不洗的细胞传代后，次日一般要换液一次，除去没有贴壁的死细胞．如果是悬浮生长的细胞则不用处理。
2、用离心洗涤来出去残留胰酶是不必要的，增加污染机会，也造成细胞丢失，还会使些一些细胞死亡。


问题3：
       以前一直养悬浮细胞，现在养贴壁细胞，总感觉消化时间老是把握不好，有时候消化过头了，损失很多细胞；有时又消化不充分，导致吹打时候困难，恳请各位给予指点！
解答3：
       消化时间和细胞类型、消化液的消化能力、细胞的密度等多种因素有关。一般养一种新的细胞要摸索一下消化时间，掌握细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强，配好后可分装成小管，一次用完，其余冻在－20℃，以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可，可放入培养箱中，因外在37℃时酶的活力高于常温，有利于缩短消化时间。还有一种方法，就是将胰酶铺满瓶底后，轻摇培养瓶，使胰酶与细胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若细胞密度过大则消化后细胞易成团。#p#分页标题#e#
       消化时间不应超过5分钟，否则对细胞损害很大。消化液覆盖细胞，成一薄膜，然后反复倾斜，使消化液冲刷细胞，当细胞收缩，部分细胞脱落时，可用完全培养基马上中和，同时吹打壁上细胞。应该没问题。
       消化的时间不能一概而伦，要看你的细胞的种类，即使同一种细胞，在不同的细胞株也回出现消化的时间不同的现象，象我们实验室以前的VERO细胞就很好消化，一般就是2-3分钟左右，现在重新拿了一株新的VERO细胞平均每次消化在5分钟以上；其次要看你配的胰酶的质量，如果配的比较好，消化的时候就要好消化一点，反之就久一点。还要在你看到消化过头的情况下，如果细胞下来的比较多了，这时你把CMF或PBS连同细胞弃去是很浪费的，你还不如就连同CMF或PBS加上营养液一起传，因为营养液中有血清，胰酶一遇到血清就会自动终止消化，当然这样对你的细胞是有一定的影响的，但是这也是补救的**方法，我消化过头的时候都是这样处理的，只要你的血清质量够好，细胞一般都会张的较好。


问题4：
       本人用胰酶冷消化细胞后，终止消化后，发现絮状的组织细胞怎么也吹不散，都不容易移入培养瓶。是为什么呢？
解答4：
       我们实验室使用胰酶消化细胞时胰酶并不预热，而是直接从4摄氏度冰箱中取出在室温中直接使用，对消化效果影响不大。不过我想可能有几个原因：
       其一：细胞生长过度，也就是在有限的空间里面细胞数量太多，相同时间内消化进行不彻底，导致大量细胞间连接没有破坏掉。
       其二：消化时间不够。
       其三：楼上所说的情况我还没有经历过，可能也存在吧。不过我想应该取决于楼主用胰酶消化的细胞的性质。
       在培养人前列腺癌细胞PC-3M时也遇到过类似问题。当时是准备做流式，看药物对细胞周期和调亡的影响。shou先排除了药物对细胞的影响，后来发现可能是由于细胞属高度转移的细胞系，贴壁不牢，常规消化会破坏细胞膜，出现非常难吹散的白色絮状物。于是尝试了以下两种方法：1、加入消化液使其扑满瓶底后迅速将其倒出，缩短消化时间。2、不使用消化液，用培养液直接将贴壁细胞吹打下来。此法会造成细胞丢失，但完全避免了消化液消化过度的影响，在细胞量较大时可尝试。此外，还在文献上看到常规消化后，加入含血清的PBS洗细胞，终止残存消化液的作用，我没有亲自尝试过。
       其实冷消化和热消化都无所谓，当然一般热消化会比冷消化要好一点，因为胰酶在加热时活性高一些，这取决于你的细胞．出现絮状物可能是你的细胞破碎后DNA释放造成，你可以试用ＤＮａｓｅ把它裂解掉．我也曾遇见过类似情况，加ＤＮａｓｅ就没有了．当然也可能是其它原因，你可以摸索一下．ＤＮａｓｅ使用浓度一般２０－３０ｕ／ｍｌ，你可以在配胰酶时直接加到胰酶中．