细胞培养技术重点Summary
一、名词解释
1、 细胞培养技术： 指从体内组织取出细胞在体外模拟体内的环境使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术
2、 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。
3、 传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。
4、 细胞系：原代细胞**传代成功后即可成为细胞系
5、 细胞株：通过选择法或克隆法形成法从原代培养物或细胞系中获得特殊性质或标志，并保持这些特性的培养物。
6、 培养用液：培养液是维持细胞生存和生长所需的基本溶液。除培养液外，还有各种杂用液。培养用液主要分为三类：平衡盐溶液、天然培养基、合成培养基。
7、 天然培养基：在细胞培养中使用**早，也**有效，主要来自动物体液或从组织中分离提取制备的成分，其营养性较高，但成分复杂，个体差异较大，另外在来源上也有一定的限制。
8、 贴壁依赖性：细胞生长时需要附着于某些带适量正电荷的固体或半固体表面，大多数动物细胞体外培养时，均以此种方式生长。
9、 合成培养基：按人和动物体内细胞所需成分模拟合成的、配方恒定的一种较理想的培养基。但对动物细胞来说，它也只能维持细胞的生存，要想使细胞生长和增殖，还需补充部分天然培养基，即把两者混合在一起使用，效果才更好。合成培养基的出现，促进了组织培养的发展，减少了生物个体差异的影响。
10、 平衡盐溶液BSS ：是从Ringer 生理盐水发展起来的，主要由无机盐和葡萄糖组成。BSS 中的无机离子不仅是细胞生命所需成分，而且对维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度方面，起着重要作用。
二、简答题
1、细胞冻存与复苏要点与注意事项
细胞冻存要点
(1)冷冻过程要缓慢.需要冷冻保存的细胞先在4℃冰箱中放置 30-60分钟;然后转入-20℃,放置30分钟;然后再转入-80℃放置16-18小时(或过夜);**后放入液氮中长期保存.有条件的地方,可用程控降温仪,按每分钟-1 到 -3℃速度降温,一直到-80℃以下,然后直接放入液氮中长期保存.
(2)冻存细胞必须处在对数生长期,活力大于90%,无微生物污染.
(3)细胞浓度控制在:1×107-5×107/ml.
(4)使用高浓度血清或蛋白保护剂.一般情况下,用于冷冻保存完全细胞生长培养液中血清浓度大于20%.
(5)使用合适的细胞冷冻保护剂,以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏.目前,**常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜),使用终浓度为5-10%.但是,有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂,如人白血病细胞系HL-60.因为,DMSO能诱导HL-60细胞分化.在这种情况下,可选用其它冷冻保护剂,如甘油(glycele),羟乙基淀粉等.
注意事项
(1)细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1小时,以防止冰晶过大而破坏细胞.也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中,但这样做细胞存活率要低一些.
(2)DMSO稀释时会释放大量热量.因此,DMSO不能直接加到细胞液中,必须事先配制.
(3)DMSO 必须是细胞培养级别的.新买的DMSO本身处于无菌状态,**次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中,4℃保存.避免反复冻融造成DMSO裂解产生有害物质.并可减少污染机会.如要过滤DMSO,必须选用耐DMSO的尼龙滤膜. 细胞冷冻保存液主要成分:冷冻保护剂,基础培养液,血清或蛋白.
冷冻保存细胞复苏要点与注意事项:
细胞复苏要点
(1)从液氮中取出冻存的细胞,立即放入37℃水浴中快速解冻.
(2)将1-2ml 冻存细胞液加入到25ml新鲜完全细胞生长培养液中,轻轻混匀.
(3)用80g 离心2-3分钟,弃上清液.
(4)用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团,并计数细胞.
(5)接种细胞到培养瓶中,起始密度为3×105/ml.
注意事项
(1)解冻时务必注意安全,预防冷冻管爆裂.,要带手套,用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出,放入37℃水浴中.切不可直接用手,以免冻伤.
(2)冷冻管在水浴中解冻时,液面不可超过冻存管盖面,否则,易发生污染.
(3)快速解冻.冻存细胞从液氮中取出后,应立即放入37℃水浴中,轻轻摇动冷冻管,使其在1分钟内全部融化(不要超过3分钟).
(4)解冻操作过程动作要轻.由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱,不仅解冻速度要快,而且动作要轻.一般情况下,解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养(1ml 冻存细胞液加入到25-30ml新鲜完全培养液中),24小时后再用新鲜完全培养替换旧培养液,以去除DMSO.如果,细胞对冷冻保护剂特别敏感,那么,解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂,然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中.
2、细胞培养基本条件
（1）合适的细胞培养基
合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的**重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养 和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境.#p#分页标题#e#
（2）优质血清
目前,大多数合成培养基都需要添加血清.血清是细胞培养液中**重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分.
（3）无菌无毒细胞培养环境
无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的shou要条件.在体外培养 的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡.因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物.
（4）恒定的细胞生长温度
维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.
（5）合适的气体环境
气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳. 细胞培养基种类与基本成分 细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的培养基jue大部分是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类.干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便.每种细胞都有其合适的培养基,
3、常用的合成培养基种类
(1).MEM细胞培养基系列
(2).DMEM细胞培养基系列
(3)RPMI-1640细胞培养基系列
(4).199细胞培养基系列
(5).水解乳蛋白细胞培养基
(6)欧氏平衡盐
(7)F-10,F-12细胞培养基系列
(8)其它类型细胞培养基
4、传代细胞分散后要经历的那些阶段，什么阶段细胞继代**合适
细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：
1．潜伏期（Latent Phase）。
细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。
2．指数增生期（Logarithmic growth Phase）：这是细胞增值**旺盛的阶段，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。
3．停滞期（Stagnate Phase）：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。
指数增生期末更适宜细胞继代
5、简述细胞计数步骤
1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
3、静置3分钟。
4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
6、简述细胞污染的种类，及检测方法
细胞污染种类有细菌，真菌，支原体，外源病毒
细菌和真菌检测方法
可用TG,GA，GP检测，
TG浑浊表示污染细菌，GA斜面有白色污染物表示有真菌污染
GP混住表示有真菌污染。
支原体污染的检测
支原体检测可用液体培养基和支原体固体培养基，液体培养基变色只能怀疑有支原体污染，移植后仍有同样颜色变化，或固体培养基出现荷包蛋样菌落则判断污染支原体。
外源病毒检测
致细胞病变病毒的检验
红细胞吸附病毒的检验
特定病毒的检验
细胞系来源动物的原代细胞；
对疫苗使用对象动物致病性病毒敏感的细胞；
对相应病毒敏感的细胞。
间接免疫荧光试验
PCR试验
7 细胞传代要点与注意事项
细胞传代方法
1、贴壁细胞
（1）洗掉旧培养液；
（2）、用无钙镁PBS洗涤细胞一**二次；
（3）、加入适量Trypsin-EDTA溶液
方法一：37℃或温室作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆颗粒状时，洗掉消化液，轻敲培养瓶边缘使细胞自瓶壁脱落，然后加入适量的新鲜培养液，与脱落的细胞或细胞团块混合均匀后，依稀释比例转移**新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。
方法二：37℃或室温作用数分钟，待细胞自瓶壁脱落后，加入适量含血清的新鲜培养液，以终止trypsin作用，离心后除去上清液，或不作离心处理，添加新鲜培养基后依稀释比例传**新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。#p#分页标题#e#
2、悬浮型细胞
（1）、吸去细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm、5min
（2）、吸除上清液，加入适量的新鲜培养基，与沉淀细胞混合均匀后，依稀释比例转移**新的培养瓶中，依正常条件继续培养。
细胞传代时注意事项
（1）、紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后**少半个小时后再进入。
（2）、所有的实验器材都要经过消毒处理，所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注意不要用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶的瓶口微微翘起。
（3）、细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境，补加生长液后要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是一个一个的。
（4）、传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次**好只能进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。PBS，培养液和消化液应严格分开。
（5）、每天观察细胞状态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长**致密单层后即可传代。
8 细胞培养目的与用途
药物研究与开发
(1) 新药筛选:如化学合成药物药效研究,中药有效成分筛选与鉴定等.
(2) 疫苗研究与开发:如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等.
(3) 基因工程药物研究与开发:如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等.
(4) 细胞工程药物研究与开发:生物活性多肽研究与开发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发.
(5) 单克隆抗体制备:包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体.
基础研究
(1) 药物作用机理
(2) 基因功能
(3) 疾病发生机理
生物制药
(1) 疫苗生产:如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等.
(2) 基因工程药物生产:如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素,粒细胞生长因子,胸腺肽等
(3) 诊断用和药用单克隆抗体生产
(4) 细胞工程药物生产:生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等
9 无菌操作要求
（1） 手指不能触及使用端。如触及，器材需更换或灼烧后再使用
（2） 减少手与器材的接触面，学会手指操作。
（3） 一切操作，如打开或封闭瓶口，安装吸管、注射器等，都要在火焰前方进行。使用前需经过火焰消毒后方可使用。
（4） 瓶口顺风斜放在支架上，试剂用后立即封闭瓶口。瓶口长时间敞开会增加落菌的机会。
（5） 不同的细胞同时操作时，要专管专用，并要勤换吸管，防止扩大污染和交叉污染。
（6） 瓶口液滴不能倒回瓶内。尽量用酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。
（7） 操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。
10 清洗玻璃器皿（新、旧）
旧的不知如何描述好！待补充！！！
清洗后的玻璃器皿：干净透明无油迹、不能残留任何物质
包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤
浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉
› 新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等
› 先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质
› 再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉
› 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上
刷洗：
› 用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质
› 刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度
浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中
› 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质
› 浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面
› 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时
清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）
› 强清洁液 63∶1000∶200
› 次强清洗液 120∶ 200∶1000
› 弱清洁液 100∶ 100∶1000
配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。
11 胰蛋白酶的配制方法
（1） 按照试验需要称取酶粉，用少量D-HANKs液将胰蛋白粉调成糊状。
（2） 加适量D-Hanks液（橙红色），低速磁力搅拌（室温和4°间段进行，室温高于30°时要减少胰酶在室温下的搅拌时间）直**酶液溶解。
（3） 溶解后的酶液（深红色），滤过除菌，小瓶分装，-20°C冻存。#p#分页标题#e#
12 血清灭活
待补充！！！
血清质量好坏是实验成败的关键。
血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子 ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分
常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量**好。
优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。
血清的灭活
(1) 选用与血清瓶同规格的对照瓶一个
(2) 对照瓶内放入鱼血清等体积的水
(3) 温度预试：水浴锅2-3支体温计56°
(4) 血清灭活、消除补体活性：56 ℃ ，30 分钟
(5) 大瓶血清灭活后进行分装
(6) 分装后，抽样做无菌试验 -20~-70°保存
13 培养细胞的生命期
所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。
1．原代培养期：
也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到**次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。
2．传代期：
初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间**长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以**完全停止，细胞进入第三期。
3．衰退期：
此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，**后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性非同一性状。
