细胞培养之细胞计数

实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
一.准备工作：
   取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用.
二.细胞悬液制备：
   用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数：
   1.取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.
   2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑。活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
  3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
  4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
  5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×10⁴
说明：/4因为计数了4个大格的细胞数；×2因细胞悬液：染液=1：1稀释；×10⁴因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm³ 而 1ml＝1000mm³  
四.细胞计数要点：
  1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于10⁴个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中； 
  2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
  3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；
  4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
  5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
五.初学者易犯的错误：
  1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。
  2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
  3. 滴入悬液时的量太多，**使细胞悬液流入旁边的槽中。 
六.本实验特殊试剂的配制：
4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水**100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。
使用液：使用时，用PBS稀释母液**0.4％即可。
细胞的冻存
1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。
2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。 
3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。 
4.置于液氮罐中长期保存。  
5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。  
注意事项：
1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以**于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时**好戴上手套操作。 
2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。
3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。
简便方法：
胰蛋白酶液消化>>离心>>PBS液1ml洗涤，吹打制成待测细胞悬液>>取1ul悬液+9ulPBS>>细胞计数：
1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.
2.用10ul枪头将细胞悬液注入计数板，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）的细胞数目。
4.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：

（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×10⁶