【实验目的】
1. 掌握DMEM培养基、胰酶的配制
2. 学习针头滤器的使用方法
【实验原理】
一．细胞培养的基本条件
1. 气体环境
气体是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生能量和合成各种成分。二氧化碳主要维持培养基的pH，并作为碳源。一般用5%的空气和5%CO2来提供动物细胞的气体生长环境。氧分压过大，不利于细胞生长。植物组织或细胞一般不需要额外提供CO2。
2. pH环境
细胞生长的pH环境为：7.2-7.4，不同细胞有所差异。一般细胞耐酸性比耐碱性大些。 CO2对培养基pH的影响： CO2是细胞的代谢产物， CO2的释放必然会影响培养基 的pH。
CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3-
所以，培养基中要加一些缓冲剂，以保持 pH的稳定，如 NaHCO3 、HEPES等
3. 糖类
葡萄糖------细胞的主要营养物质，为生命活动提供能量
糖类在生物体内的功能不仅仅是提供能量，与蛋白质和脂类共同构过程结构材料和生物活性物质。
体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基中都以葡萄糖作为能源材料，根据不同细胞的代谢特点，所加葡萄糖浓度有所不同。植物细胞培养一般以蔗糖作为能源物质。
4.氨基酸
所有细胞多需要以下12种氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸 另外所有细胞都需要谷氨酰胺，其具有特殊作用—促进氨基酸进入细胞膜，参与核酸合成，也是能源和碳源。
5.维生素
在细胞代谢中起调节作用，虽然所需甚微，但为机体正常代谢不可缺少。
6.促生长因子
培养基中除上述营养成分外，还需要促细胞生长因子，已知有许多激素具有促细胞增殖作用。
血清是提供促细胞生长因子和其他细胞所需物质的来源。
二．天然培养基与合成培养基
1.天然培养基
常用的天然培养基有血清、血浆、水解乳蛋白和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）、鼠尾胶原等。
优点： 营养成分丰富，培养效果好
缺点： 来源受限。
成分复杂，影响某些实验产物的提取和结果的分析
易发生支原体污染
2.合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如DMEM、 RPMI-1640、 TC199、MEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低
缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
培养基的主要种类（基础培养基）：
单纯的基础人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长 和繁殖，还需补充一定量的天然培养基
完全培养基的组成
基础培养基 80％一95％
血清 5％一20％
碳酸氢钠 2.0 g/L
青、链霉素 各100单位／毫升
血清的功能：提供基本营养物质、提供贴壁及扩展因子、激素及各种生长因子，有一定的保护作用无血清培养基
三，消化液
1.胰酶溶液：0.1-0.25% ,pH一般在8左右 ，受Ca2+、Mg2+、血清的抑制。
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks缓冲液配制,常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。
胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
2.EDTA溶液：解离细胞，0.02%，可以和胰酶混合使用 #p#分页标题#e#
3.胶原酶溶液：用于上皮细胞的原代培养，作用于胶原，
对细胞影响很小。
4.pH调整溶液：常用的有HEPES和NaCO3
5.谷氨酰氨补充溶液：**好配成100´ 的母液
6.抗生素溶液：常用青霉素和链霉素（双抗），配成 100´ 的溶液
四．培养基的选择：
比较不同的培养基的细胞生长曲线、生长状态、集落形成率等，选择**佳培养基
建立某种细胞株的培养基，通常也是**培养基
根据细胞的特点、实验需要，查阅文献、询问同行**等
【实验步骤】
(一） DMEM培养基的配制
1. 三袋DMEM粉末用双蒸水溶解（先加入2/3DDW，再用DDW冲洗袋子）、
磁力搅拌器搅拌半小时以上。
2. 加入1.2g/袋 NaHCO3定容3000 mL、搅拌30分钟。
每人在超净台内用大滤器过滤、分装、写好种类、名字。（留取少许做污染测试放CO2培养箱72小时）
3. 每8个人为一组，每人过滤90 mL，其余的过滤到100 mL试剂瓶中，每瓶90mL培养基备用。
使用前在超净台内加入56℃灭活好的FCS 10 mL，使血清的终浓度为10%，4℃保存待用。
（二）胰酶的配制
1. 取实验一中准备好的D–Hanks 液 200 mL （8人一组）
2. 称取0. 5g胰酶（0.25%）放入研磨器中并加入少量D –Hanks液成为糊状，研磨200次，再加入D –Hanks液终体积为200ml，合并胰酶，加0.02%EDTA助消化，磁力搅拌使之完全溶解。（8人一组，分别研磨，再合并）
3. 用NaHCO3 调pH**8.0。
4. 小滤器（实验一中已湿热灭菌过的）过滤除菌**小瓶内,(不能装的过满,防止冷冻后瓶爆裂)、检查滤器、贴好标签、-20℃保存。每人过滤20 mL 。
（注意：1.拧紧滤器2.注射器吸液体3.注射器插好滤器4.对着烧杯慢推压针芯看是否漏5.如不漏对小瓶过滤。6.滤器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体，反复多次，滤完。7.检查滤器滤膜是否完好。）
【实验结果】
配胰酶的时候因为研磨不好又做了一次。
【思考题】
1.细胞培养中为什么添加血清？
答：加血清是为了：提供基本营养物质、提供贴壁及扩展因子、激素及各种生长因子，有一定的保护作用无血清培养基
2.使用血清需注意哪些方面？
答：血清质量好坏是实验成败的关键。
常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量**好。
优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。
血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟
血清的消毒：过滤除菌
3.消化液胰酶的浓度是多少？
答：浓度是0.25％
4.使用小滤器过滤要注意哪些？
答：小滤器要灭菌后使用；
一般适合于少量液体过滤，液体量不能过多；
有些有机物质可以溶过滤器的膜，所以小滤器不适合过滤有机物；
使用前要用推注气体的方法检验过滤膜是否完好无存。
