1、培养目的： 神经细胞原代培养是研究神经组织形态结构和功能及其在缺血缺氧等各种损伤条件下的病理变化的重要方法之一。希望通过较简单的实验方法能较容易地培养出生长状态良好的神经细胞,为研究大脑皮层神经细胞的生物学特点及各种与神经细胞相关的实验研究提供较好的体外模型。
2、实验室条件：
超净工作台、培养箱、倒置显微镜、冰箱、冷冻保存装置、细胞计数板和电子细胞计数仪、
离心机、PH计、天平、水纯化装置、高压蒸汽消毒装置、电热干燥箱、过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液器、特殊用具、杂用品
3、培养方法：
1）培养基的选用（含应补充的附加成分）及培养所需的其它用液；
10 %马血清DMEM培养液（含90 %DMEM 液,10 %马血清）, 10 %马血清,含终浓度为3～6 mmol/ L 的HEPES ,添加终浓度为6. 25 mmol/ L 的NaCl ;Neurobasal 培养液中含98 %Neu2robasal 液,2 % B27 添加剂,含终浓度为3～6 mmol/ L 的HEPES ,添加终浓度为6. 25 mmol/ L 的NaCl 。DHanks 液(除常规配方外,添加终浓度为6. 25 mmol/ L 的NaCl)
2）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）；
1 新生24 h 内大鼠置- 20 ℃冷冻10 min ,于无菌条件下取出两大脑半球,置于盛有4 ℃DHanks 液(除常规配方外,添加终浓度为6. 25 mmol/ L 的NaCl) 的平皿中,在显微解剖镜下彻底剥去脑膜、血管,去除脑白质,取大脑皮层并用DHanks 液漂洗两遍,将皮层剪碎成1 mm
3 小块(冰上操作)
2 在37℃条件下用0. 125 %胰蛋白酶消化20 min ,中间振摇1～2 次。
3 消化完全后用等体积的4℃ 10 %马血清DMEM 培养液终止消化并漂洗两遍,将细胞团块转入另一无菌离心管中,加入适量的4℃10 %马血清DMEM 培养液后用长嘴巴氏吸管吹打数次(注意尽量不产生气泡) ,静置5min 后收集上层细胞悬液,重复上述步骤两次。
4 将细胞悬液过70μm Zellsieb 网筛后,以1000 rpm 速度,离心5 min ,弃上清,
5 用10 %马血清DMEM 培养液重悬细胞并调整密度**5 ×105 个/ ml ,接种细胞于预先涂布有0. 1 ‰多聚赖氨酸(Sigma) 的培养板(6 、24 孔板每孔分别接种2. 0 ml 、0. 4 ml)内,
6 于37℃、饱和湿度5 %CO2 培养箱内进行培养,4h 后用含2 %B27 的Neurobasal 培养液给细胞全量换液(6 、24 孔板每孔分别1. 0 ml 、0. 3 ml) ,以后每3 d 半量换液1 次。
7 神经细胞接种1h 后即有细胞贴壁,培养4h 后jue大部分细胞已贴壁,并可观察到有相当数量的细胞长出突起,胞体透亮,光泽明显,细胞活性好,此时将细胞从有血清培养环境换成Neurobasal 无血清培养环境继续培养
3）培养过程的观察的注意事项；
①实验动物为新生24 h 内大鼠,而可不用胎鼠
②接种细胞后用10 %马血清DMEM 培养液培养4 h ,之后用Neurobasal 全量更换培养液继续培养, 要增加神经细胞贴壁生长能力,预先用多聚L - 赖氨酸处理培养板也是关键之一
③Neurobasal 培养液渗透压为235 ( ±10)mosM ,多用作胎鼠大脑神经细胞培养,而用于成年大鼠神经细胞培养的液体渗透压约为260 mosM
④本方法培养神经细胞,不需额外加入阿糖胞苷等抑制胶质细胞分裂的药物,也能获得较纯的皮层神经细胞,关键是剥离脑膜、血管、白质要彻底。
⑤培养板处理方法很重要:shou先应彻底清洗干净,包括泡4 %硫酸清洁液及分析纯级100 %乙醇;另外在培养孔内放置盖玻片(盖片处理基本同培养板,只是需泡含80 %浓硫酸的清洁液) ,再用多聚赖氨酸包被盖玻片,使神经细胞更好贴壁生长,提高培养效果。
⑥由于神经细胞比较娇嫩,制备单细胞悬液过程中要求操作轻、稳,吹打时忌产生气泡。另外整个制备单细胞悬液过程在冰
上进行,能更好地保持细胞活力。
⑦整个实验过程一定要无菌操作。
4、目的细胞的鉴定方法：
1）具体方法（可列1～3种）；大脑皮质神经元纯度的鉴定( Nissl’s 染色)
将细胞爬片的小玻片用0. 01 mol/ L 的PBS 漂洗,40 g/ L 多聚甲醛固定,再用10 g/ L 甲苯胺蓝染色,梯度酒精(70 %、80 %、95 %、100 %) 分色,置倒置相差显微镜下,随机观察并计数30 个视野(目镜10 ×,物镜20 ×,框面积0. 3 mm2 ) 内的神经细胞数。
2）应出现的结果：阳性；阴性。
培养第3 d 的神经细胞,胞核淡染,偏于一侧,胞体饱满,蓝紫色颗粒不均匀分布于胞浆中,同时可见胞核蓝染、胞质淡染、平铺于板底的非神经元。经Ara2C 作用24 h 后,**培养第6 d ,可见神经细胞胞体增大,胞质内尼氏颗粒增多,非神经细胞明显减少,神经元纯度可达92 %以上,便可用于进一步试验研究。
5、困难及解决办法：
1） 获得较纯的皮层神经细胞：熟悉大鼠的大脑局部解剖，剥离脑膜、血管、白质要彻底，操作过程中动作轻柔。
2）在实验准备阶段器清洗器械时要细致认真。若忽略培养瓶内的细小的杂质，可导致在培养过程中一些杂质也在瓶内生长
3）自身专业技能不熟练，吹打是过多气泡产生，无菌观念不强等原因，在培养过程中导致细胞死亡。
