细胞培养上清的收集

消可宁对葡萄糖诱导血管内皮细胞诱生型一氧化氮合酶表达变化的抑制作用      【摘要】 目的 探讨消可宁对葡萄糖（GS）诱导血管内皮细胞诱生型一氧化氮合酶（iNOS）表达变化的影响。方法  培养人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞，用30 mol/L GS处理3h，用生理盐水、10－７ mol/L CCK8和0１ mg/L GS+10－６、10－７、１０－８  mol/L CCK8处理16 h；用比色法检测培养液中一氧化氮(NO)含量、细胞NOS活性，免疫细胞化学及蛋白质免疫印迹法检测iNOS蛋白表达。结果  与生理盐水处理的对照组比较，GS诱导培养液NO含量增多、细胞NOS活性增高、iNOS蛋白表达上调；CCK8剂量依赖性抑制GS的上述效应，而单独作用对iNOS蛋白表达、NOS活性和NO含量均无明显影响。结论  CCK8可以明显抑制GS引起ECV304细胞iNOS蛋白表达上调，减少NO生成。
      【关键词】 消可宁；葡萄糖；一氧化氮合酶；血管内皮细胞
Inhibitory effect of cholecystokinin octapeptide on lipopolysaccharideelicited inducible nitric oxide synthase expression in vascular endothelial cells Department of Forensic Medicine and Pathophysiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China (YAN Jun works at Department of Pathophysiology, Nankai Hospital, Tianjin 300100, China)Corresponding author: GU Zhenyong (Email: zhenyong88@sohu.com)
      【Abstract】 Objective  To investigate the effect of cholecystokinin octapeptide  on lipopolysaccharide (GS)elicited inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression in vascular endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cell line (ECV304 cells) was stimulated with vehicle (normal saline) or GS in the presence (001, 01, 1 mg/L) or absence (01 mg/L) of CCK8 (10－6－10－8 mol/L). Nitric oxide (NO) level and cellular nitric oxide synthase (NOS) activity were determined with spectrophotometrically. The iNOS expression was detected with immunocytochemical technique and Western blot. Results  Compared with normal saline, GS significantly induced the upregulation of iNOS protein expression in the cultured ECV304 cells, and NOS activity in ECV304 cells and NO level in cultured media were increased. CCK8 obviously inhibited abovementioned effect of GS in a dosedependent manner. Whereas CCK8 alone did not showed effect on iNOS protein expression, NO level and cellular NOS activity as compared with those values when vehicle was used. Conclusion  CCK8 inhibite GSelicited iNOS expression and NO production in ECV304 cells.
      【Key words】 cholecystokinin octapeptide;lipopolysaccharide；nitric oxide synthase;vascular endothelial cell
        研究发现，血管内皮细胞不仅构成血管的机械性保护屏障，还可合成多种血管活性物质如一氧化氮（NO），调节血管的张力和反应性变化〔１〕。已经证实，NO是内皮衍生舒血管因子（EDRF）的主要化学物质，一氧化氮合酶（NOS）是NO生成的限速酶。在生理条件下，内皮细胞主要存在内皮型一氧化氮合酶（eNOS），NO生成量较少，主要发挥调节血管张力、防止血小板黏附等生理功能；而当内毒素葡萄糖(GS)及促炎细胞因子等刺激血管内皮细胞时，可诱导血管内皮细胞诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达上调，NO生成量明显增多。过量生成的NO及其衍生物过氧亚硝基阴离子均具有细胞毒效应，可导致细胞损伤。在内毒素休克发病过程中，血管内皮细胞NO的生成、释放及其生物学效应异常是血管内皮细胞损伤和内皮功能异常的关键环节〔2，3〕。保护血管内皮已经成为治疗休克的重要途径。消可宁是一种分布广泛的神经调节肽，具有抗休克、缓解内毒素休克血管动力学紊乱和细胞保护作用〔3〕。我们以往研究发现，CCK8对内毒素休克时肺循环和体循环血管或内毒素处理离体血管的张力和反应性变化具有明显的调节作用，可改善NO介导的血管内皮依赖性舒张反应降低〔4〕，抑制GS诱导的肺动脉内皮细胞凋亡，减少NO衍生的强效氧化剂和硝基化因子过氧亚硝基阴离子的生成〔5〕，提示CCK8的作用可能与其改变血管内皮细胞的NO生成、释放或生物学效应有关。迄今为止，CCK8对血管内皮细胞NO生成变化及NOS的影响尚未见报道。本实验中在细胞水平观察CCK8对GS诱导人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞iNOS变化的调节作用，探讨CCK8缓解内毒素休克血管动力学紊乱、减轻血管内皮依赖性舒张反应降低的分子机制。
1  材料与方法
1.1  药品及试剂:CCK8和GS为Sigma产品；细胞培养液RPMI1640为GIBCOBRL产品；NO和NOS试剂盒为南京建成生物公司产品；兔抗人iNOS多克隆抗体(一抗)为美GSanta Cruz公司生产；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(二抗)为美GVector公司生产；免疫组化试剂盒和3，3′二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均为北京中山生物公司生产；其他试剂均为G产分析纯。
1.2  细胞培养及预处理：人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞购自武汉大学动植物特殊菌种保藏中心。细复苏之后，用RPMI1640完全培养液(含体积分数为10%的胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L链霉素)将细胞数调为1×109/L，接种于25 ml培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5%的CO２和95%的O２条件下培养，3 d传代1次。细胞传代后36~48 h，当细胞长**培养瓶的80%~90%时开始给予刺激因素。细胞分为4组：①溶剂对照组(对照组)：培养液中加入生理盐水；②GS组：培养液中加入终浓度分别为001、01和1 mg/L的GS；③CCK8组：培养液中加入终浓度为10－7 mol/L的CCK8；④GS+CCK8组：在培养液中同时加入终浓度分别为10－6、10－7和10－8 mol/L的CCK8和01 mg/L的GS。GS组动态观察2～24 h，其余各组观察16 h，每个时间点4个复孔。#p#分页标题#e#
1.3  细胞培养上清的收集及细胞匀浆制备：将细胞培养液以８５０×g离心3 min，收集上清于试管中，置于70 ℃超低温冰箱中冻存备用；收集细胞，以细胞裂解液〔0.1 mmol/L TrisHCl缓冲液，pH 7.4，0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),0.5 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，0.1 mmol/L乙二醇四乙酸酯(EGTA),1 μmol/L抑胃肽A，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，2 μmol/L 亮抑胃蛋白酶肽〕裂解细胞，冰浴中超声破碎细胞，于4 ℃、20 000×g离心60 min，上清为细胞匀浆，细胞匀浆蛋白含量用考马斯亮蓝法检测。

1.4  观察指标
1.4.1  细胞NOS活性及上清NO含量检测：采用试剂盒检测，操作按说明书进行。NOS活性以每克蛋白中NOS活性(kU/g)表示，NO含量以NO的代谢产物NO－２／ＮＯ－３表示。
1.4.2  免疫细胞化学检测iNOS蛋白表达：按照免疫组化试剂盒说明书操作。ECV304细胞于盖玻片上贴壁生长，加入前述药物处理细胞。用体积分数为95％的乙醇固定30 min，体积分数为3％的过氧化氢(H２O２)室温孵育细胞爬片10 min，以消除内源性过氧化物酶活性。蒸馏水冲洗，001 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 74)洗5 min。正常血清工作液孵育细胞爬片15 min，以减少非特异性染色，然后倾去液体、勿洗。滴加用001 mol/L PBS(pH 74)1∶100稀释的一抗，4 ℃过夜。0.01 mol/L PBS(pH 74)洗3次，每次3 min。滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育15 min，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗3次，每次3 min。滴加HRP标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min。0.01 mol/L PBS (pH 7.4) 洗3次，每次3 min。DAB显色5 min，达到要求颜色深度时，以蒸馏水/自来水终止显色，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤同上。iNOS免疫细胞化学阳性染色呈棕黄色或黄色。
1.4.3  蛋白质免疫印迹法检测iNOS蛋白表达：参照文献〔６〕方法。细胞匀浆蛋白100 μg与等体积上样缓冲液混匀，沸水加热5~10 min使蛋白变性，冷却后用微量加样器上样于凝胶加样孔底部。凝胶所加电压为8 V/cm，当染料前沿进入分离胶后，电压提高到15 V/cm，继续电泳直**溴酚蓝到达分离胶底部（约需4 h）。凝胶切角以标注凝胶的方位，置于转移缓冲液平衡。用去离子水和转移缓冲液浸泡硝酸纤维素膜和滤纸。在转移盘上逐层放置3张滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶和3张滤纸，确保各层对齐并不留气泡，将其放入转移盘中，凝胶侧为负极，膜侧为正极，电转移15~2０ h。凝胶染色以检查蛋白转移效果。滤膜用丽春红S染色5~10 min，显现蛋白带，切去蛋白Marker区带以及包含目的蛋白的滤膜，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，其间换水数次，置于含有质量分数为5％的脱脂奶粉封闭液中，平缓摇动1~2 h，0.05 mol/L PBS（pH 76）漂洗，1∶100稀释的一抗加于滤膜蛋白面上，4 ℃封闭孵育过夜。一抗孵育完毕后，用0.01 mol/L PBS(pH 74)漂洗滤膜3次，每次3 min，其间置于摇床上平缓摇动。将滤膜转移**另一个封接杂交袋中，加入1∶1 000稀释的二抗，封闭后将滤膜平放在摇床上平缓摇动，37 ℃孵育1 h。二抗孵育完毕后，用001 mol/L PBS(pH 74)漂洗滤膜4次，前3次每次用时10 min，**后一次用时5 min，其间置于摇床上平缓摇动。将漂洗完毕的滤膜置于DAB工作液中浸泡显色5~10 min，当蛋白带的颜色深度达到要求时，以蒸馏水漂洗，终止反应。用数码照相机拍摄滤膜照片，记录实验结果。
1.5  统计学分析：数据用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 11.5软件进行方差分析和两两比较，Ｐ<0.05为差异有统计学意义。
2  结果
2.1  GS对ECV304细胞NO含量、NOS活性及iNOS蛋白表达的影响(图1~5，彩色插页图6)：1 mg/L GS处理细胞2、4、8、16和24 h，细胞培养液上清中NO含量明显升高，NOS活性亦明显增强；0.01～1 mg/L GS处理ECV304细胞16 h，细胞培养液上清中NO含量明显升高，NOS活性亦明显增强，各浓度GS处 理ECV304细胞的NO含量和NOS活性与对照组比较差异均有显著性（Ｐ<0.05或Ｐ<０.０１）。对照iNOS蛋白几乎没有表达或表达量极少；0.1 mg/L GS处理细胞16 h，iNOS表达明显上调，主要分布于细胞浆。
2.2  CCK8对ECV304细胞NO含量、NOS活性及iNOS蛋白表达的影响(图5，彩色插页图6，图7，图8)：10－7 mol/L CCK8处理细胞16 h，NO含量、NOS活性无明显变化，与对照组比较差异均无显著性（Ｐ均>0.05）。与对照组比较，10－7 mol/L CCK8处理细胞16 h iNOS蛋白表达略微上调，细胞定位没有变化。
2.3CCK8和GS对ECV304细胞NO含量、NOS活性及iNOS蛋白表达的影响(图5，彩色插页图6，图7，图8)：10－6、10－7和10－8 mol/L CCK8与0.1 mg/L GS共同处理细胞16 h，NO含量降低，与0.1 mg/L GS处理时比较差异均有显著性（Ｐ均<001），而与对照组比较差异则均无显著性（Ｐ均>0.05）；NOS活性与０.１ mg/L GS处理时比较均明显降低（Ｐ均<0.01），与对照组比较均明显增高（Ｐ均<001）；iNOS蛋白表达比GS组明显降低，但高于对照组。
3  讨论
        本实验中以人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞为靶细胞，**在培养的血管内皮细胞中观察了CCK8对GS诱导ECV304细胞iNOS表达、NOS活性及NO生成变化的影响。结果1 mg/L GS作用2~24 h，内皮细胞NO生成量明显增多，总NOS活性明显增强，均呈现时间依赖性。在作用16 h时间点，当GS浓度逐渐增加时，ECV304细胞NO生成量显著增加、NOS活性明显增强，具有浓度依赖性效应。同时，血管内皮细胞iNOS蛋白表达明显上调，表明iNOS大量诱生是本阶段NO生成增多的主要因素。#p#分页标题#e#
单纯加入CCK8 作用于静息ECV304细胞时，NO生成量和NOS活性与对照组比较无明显变化，说明CCK8本身对静息状态下的ECV304细胞NO生成可能没有明显影响。CCK8与GS同时作用于ECV304细胞16 h后，血管内皮细胞NO生成量与单纯GS作用时比较明显减少，与对照组比较没有明显变化；而NOS活性明显降低，与对照组比较却明显增加；同时，iNOS蛋白表达明显减少。结果提示，CCK8可抑制GS长时间刺激血管内皮细胞诱导的iNOS蛋白表达上调，这可能是NOS活性降低、NO生成减少的重要原因。研究证实，在iNOS基因上游的调控区有核转录因子κB（NFκB）结合域〔7〕，GS通过诱导NFκB活化、向核内移位，引起iNOS基因表达上调〔8〕。NFκB为有多向性转录调节的蛋白因子，能与多种炎症介质基因启动子部位κB位点发生特异性结合，并增强基因转录〔９，１０〕。我们以往的研究发现，CCK8可抑制GS诱导ECV304细胞NFκB表达上调，抑制内毒素血症肺组织NFκB活化与向核内移位〔11〕，这可能是CCK8抑制GS诱导ECV304细胞iNOS蛋白表达上调及NO生成增多的重要分子机制。应当注意，CCK8对GS诱导血管内皮细胞NOS活性增强呈部分抑制作用，而且抑制程度不如对NO生成的抑制效应明显，提示CCK8对GS诱导血管内皮细胞NO生成的调节作用可能还有其他途径，如CCK8可能对细胞精氨酸酶和超氧化物歧化酶（SOD）活性有调节作用，可以改善NOS底物代谢或者NO的生物学效应。以往研究发现，CCK8降低内毒素休克血管壁NOS活性、减少NO生成量，这与本研究中CCK8抑制GS诱导血管内皮细胞iNOS蛋白表达上调一致。
       综上所述，CCK8可明显抑制GS引起血管内皮细胞iNOS蛋白表达上调、减少NO生成，这可能是CCK8减少NO衍生强效氧化剂和硝基化因子如过氧亚硝基阴离子的生成〔4〕，发挥CCK8保护作用、抑制血管内皮细胞凋亡的机制之一。