比较细胞工厂与10L转瓶培养Vero细胞和产毒情况

一、实验目的
1、了解熟悉细胞工厂的使用，清洗及再利用的方法；
2、比较细胞工厂与10L转瓶同等条件下培养Vero细胞时各自细胞的生长状态；
3、比较细胞工厂与10L转瓶培养Vero细胞加毒之后细胞的状态变化和产毒情况；
4、通过实验分析用细胞工厂代替原有转瓶生产优缺点；
5、通过实验发现细胞工厂中常见问题。
二、主要实验工具及材料
干净的10L转瓶一个（表面积约为2278㎝²）；
NUNC公司4层细胞工厂一个（表面积为2520㎝²，编号：140360），自带一个插拔塞和旋口塞
细胞生长液；细胞维持液；毒种（CTN-1V株工作种子批毒种）
三、实验过程
（一）培养Vero细胞，观察分析及注意事项
将一瓶已长成致密单层细胞消化，制备成细胞悬液，计数后，按照每ml溶液含有1×10⁵个细胞数，及每平方厘米贴壁细胞数相同，根据面积比计算出加入ml数。加入细胞后放置于37℃恒温室中培养。
细胞悬液浓度：2.32×10⁶个/ml
 

	溶液总体积（ml）	加入细胞悬液体积（ml）	面积细胞数（个/cm2)
细胞工厂	800	34.48
10L转瓶	1500	31.03

 
观察、分析
2010-8-5
11：00   加入细胞和培养液于细胞工厂和10L转瓶中培养
13：30   观察：细胞工厂中的贴壁细胞数量较10L转瓶多，溶液中含有大量的悬浮细胞
分析：细胞工厂是静置培养，细胞贴壁较10L转瓶快
 
2010-8-6
9：10观察
细胞工厂：细胞状态良好，已伸展，分布均匀
10L瓶：细胞状态一般，少许伸展，分布稍有不均
分析：10L转瓶中的细胞贴壁不均匀，可能是由于细胞总数较少造成
 
（二）加入病毒后，Vero细胞状态的观察分析
2010-8-9
9：30观察（加毒前）
细胞工厂：细胞生长成致密单层，间隙很小，排列整齐，分布均匀
10L转瓶：细胞生长成致密单层，间隙很小，排列较整齐，分布稍有不均匀
 
加毒前更换培养液为维持液，再根据比例加入3.1ml（10L转瓶）3.4ml(细胞工厂)病毒
 
2010-8-10  9：00观察
细胞工厂与转瓶中的细胞无明显变化，状态正常，轮廓清晰
 
2010-8-11  9：30观察
细胞工厂与转瓶中的细胞状态正常，无明显病变，无悬浮细胞；10L转瓶的颜色稍浅
 
2010-8-12  9：00观察
细胞工厂与转瓶中的细胞局问成拉网状，有少量悬浮细胞出现，并且细胞工厂中的悬浮细胞较10L转瓶多，细胞工厂中的PH维持正常，颜色无变化，10L转瓶的PH维持不好，颜色变化明显，PH下降明显。
分析：细胞工厂较10L瓶透气性好，所以PH维持得好
 
2010-8-13  9：15观察
细胞工厂与转瓶中的悬浮细胞数量增多，大部分细胞病变明显，成拉网状
 
（三）收获病毒液
2010-8-16  9：30收获病毒液前观察
细胞工厂与10L转瓶中有大量的悬浮细胞，考虑收获病毒液。
收获病毒液取样：分别从细胞工厂和10L转瓶中取样于青霉素小瓶中，送样检测抗原和感染性滴度
 
四、实验结果分析
抗原结果和滴度结果
此次实验结果显示，细胞工厂制备的狂犬病毒液，抗的含量和感染性滴度均好于转瓶工艺制备的病毒液。可能与下述原因有一定关系：
（1）细胞工厂为静止培养法，接种细胞后细胞贴壁良好，分布与较均匀，而转瓶细胞贴壁时间较长，并且稍有不均，因此在一定时间内，细胞工厂细胞长势稍好一些；
（2）10L瓶的细胞表面积少于细胞工厂，接种的细胞数是按面积计算，细胞工厂总细胞数多于转瓶培养的细胞数；
（3）转瓶工艺加毒时维持液1500ml，细胞工厂维持液是800ml。
因此，细胞工厂制备的病毒液的抗原含量和感染性滴度好于转瓶工艺
在现有的条件下，很难找到与细胞工厂细胞生长面积和维持液体积一致的对照方法，只能以细胞附着的单位面积，加入细胞数条件控制，但维持液的量则无法控制，只能按常规方法加入。
 
细胞工厂每层液面均分操作：
1、将培养基直接倒入细胞工厂；
2、将细胞工厂朝有小口的一面放置，平衡一段时间；
3、将细胞工厂翻转90度，带有进液口的一面朝上，静置一段时间，培养基便会自动平均分配到每一层腔室中；
4、双手握住进液口的一面，缓慢地将细胞工厂放倒，变成水平放置，不要抓握**层边缘，以防造成损坏。
 
注意事项：
1、移动细胞工厂的时候要尽量保持水平，否则会造成每层溶液不均匀；#p#分页标题#e#
2、放置细胞工厂的平台或架子一定要水平，防止同层的细胞溶液厚度不同；
3、由于细胞工厂的进液口是熔点低的材料制成，因此火焰保护时要小心，不要使之变形；
4、清洗细胞工厂时，如用水流冲洗，切忌用较急的水流冲洗，否则将造成细胞工厂的损坏；
5、清洗后的细胞工厂放到镜下观察，还可看到少量的细胞残留在上面，不易清洗下来。根据G内其它企业的经验，细胞工厂可重复利用3-4次，但不能高压消毒灭菌，需要通过钴60照射之后再利用，增加成本；
6、四层细胞工厂放到镜下观察时，只能看到**下一层细胞的状态。10层或40层中细胞状态的观察则需要用四层细胞瓶对照观察。
 
五、细胞工厂较现在转瓶生产优缺点
优点：1、节省人力、物力、时间、空间；
2、方便地按比例扩增；
3、受污染风险低；
4、瓶间差异变小
缺点：1、可重复利用的次数较少；
2、产品价格较贵；
3、消毒需要用钴60照射；
4、清洗不方便；
5、细胞工厂量较少，按二次收获，仅收获1600ml，而转瓶可收3000ml；此次细胞工厂滴度较高可许与其收量低有关
 
六、总结
细胞工厂做为一个可用于大规模细胞培养的生产装置，具有很多的方便于细胞培养的优点，会给整个生产过程节省人力，时间，空间。但是对于Vero细胞的加毒产毒过程还存在许多细胞问题。能否用于疫苗生产，还需要考虑和解决更多的难点。