软骨细胞培养

实验方法
Ø 各种溶液的配制
1、  配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9
（1） 称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na₂Hpo₄.H₂o 0.06g, kH₂po₄0.06g， NaHco₃0.35g，酚红0.02g
（2） 依次将各成分逐个溶解于800ml水中。
（3） 用5.6% NaHco₃溶解酚红0.02克。
（4） 将酚红液（３）加入（２）中。
（5） 补加水**1000ml，混匀。
（6） 将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。
 
2、 配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml
 （1）称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。
   （2）补足Hanks液**75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。
   （3）冷却**室温后，置4℃冰箱过夜。
   （4）用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。
   （5）分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。
 
3、 配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml
（1）称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
（2）补足Hanks液**49.5ml，搅拌混匀。
（3）用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
（4）分装小瓶，低温冰箱保存备用。
 
  4、 配制闪烁液
（1）用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
（2）将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。
 
Ø 取材与培养
（1）取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自shou都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。
（2）无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎**1mm³大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。
（3）吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO₂孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。
（4） 吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO₂孵箱中继续消化3小时。每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。
（5） 用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。
（6） 过120目纱目，去除上清液。
（7） 用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度**7.5X10⁴。
（8） 将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。
（9） 置于37℃、5%CO₂孵箱中培养48小时。
 
Ø 更换部分培养基
（1） 用移液枪从24孔培养板中每孔吸出0.5ml旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
（2）同法从96孔培养板中每孔吸出100μl旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
 
Ø 加药
按照预前设计给培养孔中加A药（牛膝健步）及B药（鹿茸生长素），具体加药方法如下图。
具体加药情况
    每支鹿茸生长素加1mlDMEM稀释，PH7.0 (DMEM  PH7.2)

药  品	培养板	大剂量	中剂量	小剂量
A药(牛膝健步)	96孔板	10μl	8μl	6μl
A药(牛膝健步)	24孔板	50μl	40μl	30μl
B药(鹿茸)	96孔板	30μl	20μl	10μl
B药(鹿茸)	24孔板	150μl	100μl	50μl

鹿茸大剂量的浓度为0.12%，中剂量的浓度为0.08%，小剂量的浓度为0.04%。
测定
Ø 测II胶原的合成
关节软骨细胞DNA的合成用³H TdR的掺入量来检测。
3号板加药后48小时加同位素³H TdR及³H脯氨酸
（1）用1ml注射器抽取0.1ml ³H TdR （即0.1μci）(³H TdR及³H脯氨酸购买时浓度为    1mci/ml)。
（2） 加DMEM**0.5ml，将³H TdR配制成0.2 mci/ml浓度。
（3） 同法配制相同数量的³H脯氨酸。
（4） 根据试验前设计，按每孔5μl（即1μci）的量加入同位素。
（5） 置于37℃、5%CO₂孵箱中培育12小时。
Ø #p#分页标题#e#测定同位素的量
固定3号板细胞，测定同位素的量
    1、配置0.25%胰蛋白酶溶液
（1）用电子天平称取0.25g胰蛋酶，放入烧杯内。
（2）加入少量的D-Hanks液，充分搅拌，使其成糊状。
（3）再加入D-Hanks液**100ml，不停搅拌，直**完全溶解。
    2、固定细胞
（1）用移液管将3号板（加药后48小时加同位素）各孔的培养液按顺序吸出并置入相应的试管内。
（1） 往各孔内加入少量的0.25%胰蛋白酶溶液，并同时吹打细胞，使贴壁细胞消化脱落，消化不少于5分钟，形成细胞悬液，将细胞悬液再依次加入上面的相应试管内。
（2） 将真空泵与玻璃纤维滤膜连接。
（3） 用滴管依次将试管中的液体吸尽，滴加在玻璃纤维滤膜上，真空抽吸过滤。
（4） 用注射器分别依次抽取2ml 5%三氯乙酸（细胞固定）、5ml蒸馏水（洗去多余的同位素）、1ml无水乙醇（细胞脱色），依次加**滤膜，使细胞固定在滤膜上。
（5） 待真空泵将滤膜上的液体吸尽后，用镊子将滤膜取下，有序的置于托盘内。
（7）同上述3号板方法，根据试验前设计往4号板各培养孔中加入5μl（1μci）³H TdR或³H脯氨酸，并置于37℃、5%CO₂孵箱中培育12小时。
（8） 同昨日方法固定4号板细胞。
（9）将固定3号板及4号板细胞的滤膜依次置入对应的装有闪烁液的小塑料瓶内，闪烁 
液要覆盖滤膜。
  3、 用美G产BECKMAN  LS6500  multi-purpose  液闪仪测定各孔细胞³H TdR或³H脯氨酸的掺入值。
Ø MTT法测细胞增殖
MTT染色
(1) 用电子天平称量MTT染料0.02g。
（2）用DMEM溶解并稀释**4ml，PH值测定7.2。
（3）用0.22μm滤膜过滤除菌。
（4）根据试验前设计，往1号板与2号板相应的培养孔内，按0.1ml/孔加入MTT染色液。
（5）置于37℃、5%CO₂孵箱中培育5小时。
（6）按二甲基甲酰胺：Triton-X100：水=3：1：2的比例配置42ml脱色液（用柠檬酸调节PH**5～6）。
（7）按每孔1ml将脱色液加**1号及2号培养板相应的培养孔中。
（8）置于37℃、5%CO₂孵箱中培育3小时，期间间歇振荡十分钟，使结晶充分溶解。
（9）用移液枪在1号板与2号板各孔中抽吸0.2ml溶液按顺序加入96板培养孔中。
（10）选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值。
Ø 甲苯胺蓝染色及蛋白多糖的测定
甲苯胺蓝染色
  1、试剂配制：甲苯胺蓝乙醇液（甲苯胺蓝0.2g溶于30%乙醇100ml中）。
  2、根据试验前设计，将行甲苯胺蓝染色的培养孔中的培养液吸去。
  3、用PBS漂洗二次。
  4、用70%乙醇固定30分钟。
  5、用甲苯胺蓝乙醇液染20分钟。
6、倒置显微镜下观察并照相。
 
由于35-硫同位素试剂**今未买到,故软骨细胞体外培养后蛋白多糖的测定用甲苯胺蓝染色法完成。软骨2-型胶原的合成用同位素标记的脯氨酸掺入量进行检测。
Ø 组织胺诱导软骨细胞凋亡及吖啶橙染色
1 根据预前设计，往培养孔中加入30μl组织胺，置于37℃、5%CO₂孵箱中继续培育24小时。
2 细胞离心，去上清后将细胞悬浮于50μlPBS中。
3 加入100μl吖啶橙染色液，混匀，置于冰中染色30分钟。
4 加入1。85ml细胞固定液，混匀。
5 倒置显微镜观察。
6 进行流式细胞仪分析。
 
 
 
 
 
 
试剂
DMEM培养基（Gibco）
      胎牛血清（FBS）：五江制药厂
      Ⅱ型胶原酶：Sigma，北京吉泰联科公司分装
0.3%Ⅱ型胶原酶：取100mg胶原酶加入33ml D-Hanks液，0.22μm滤膜过滤；
DMEM培养液：90mlDMEM+10mlFBS+0.1ml青霉素+0.1ml链霉素
青霉素160万^u加Hanks16ml，即10万^u/ml
链霉素100万^u加Hanks10ml，即10万^u/ml
Trypsin（胰蛋白酶）：Gibco，邦定分装
0.25%Trypsin：0.125g Trypsin加入50ml D-Hanks液中
 
实验过程
 
2002年12月13日   星期五
一、 配制D-Hanks液(无钙镁)1L，PH8-9
1、 称量Nacl8.0g，kcl0.4g,Na₂Hpo₄﹒H₂o 0.06g, kH₂po₄0.06g，NaHco₃0.35g，酚红0.02g
2、 依次将各成分逐个溶解于800ml水中。
3、 用5.6% NaHco₃溶解酚红0.02克。
4、 将酚红液（３）加入（２）中。
5、 补加水**1000ml，混匀。
6、 将Hanks液分装盐水瓶内，110℃、8镑高压蒸汽消毒灭菌20分钟，4℃冰箱保存备用。
 
二、 配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml
1、 称取胰蛋白酶187.5mg，用少量D-Hanks液先将胰蛋白酶粉末调成糊状。
2、补足Hanks液**75ml，搅拌混匀，置40℃水浴搅拌帮助溶解。
3、冷却**室温后，置4℃冰箱过夜。
4、用滤纸粗滤，再用0.22μm微孔过滤膜过滤除菌。
5、分装小瓶，低温冰箱冰冻保存备用。#p#分页标题#e#
 
三、 配制0.3%Ⅱ型胶原酶溶液49.5ml
1、 称取Ⅱ型胶原酶150mg，用D-Hanks液溶解。
2、 补足Hanks液**49.5ml，搅拌混匀。
3、 用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
4、 分装小瓶，低温冰箱保存备用。
 
四、 取材
1、 取3kg重6月龄青紫蓝兔一只(购自shou都医科大学动物房)，兔耳静脉注射5ml空气致死。
2、 无菌条件下取双侧下肢膝，髋关节面软骨，置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪将软骨剪碎**1mm³大小,继续用D-Hanks液漂洗2次。
3、 吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白酶溶液，并置入37℃、5%CO₂孵箱中消化30分钟,中途不时摇晃。
4、 吸出胰蛋白酶溶液，加入0.3%Ⅱ型胶原酶溶液，置入37℃、5%CO₂孵箱中继续消化3小时。每1小时更换Ⅱ型胶原酶溶液1次。用离心管留取各次消化液，离心2000rpmX10min，去除上清液。
5、 用加了青霉素及链霉素的Hanks液洗1次，以同样方法再离心一次。
6、 过120目纱目，去除上清液。
7、 用含10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度**7.5X10⁴。
8、 将细胞悬液接种于24孔培养板（1ml）及96孔培养板（200μm）中，24孔板及96孔板各2板。
9、 置于37℃、5%CO₂孵箱中培养48小时。
 
2002年12月6日    星期一
一、 更换部分培养基
1、 用移液枪从24孔培养板中每孔吸出0.5ml旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
2、 同法从96孔培养板中每孔吸出100μl旧的培养基，更换同等数量新的培养基。
二、 加药：按照预前设计给培养孔中加A药（牛膝健步）及B药（鹿茸生长素），具体加药方法如下图。
具体加药情况
    每支鹿茸生长素加1mlDMEM稀释，PH7.0 (DMEM  PH7.2)

药  品	培养板	大剂量	中剂量	小剂量
A药(牛膝健步)	96孔板	10μl	8μl	6μl
A药(牛膝健步)	24孔板	50μl	40μl	30μl
B药(鹿茸)	96孔板	30μl	20μl	10μl
B药(鹿茸)	24孔板	150μl	100μl	50μl

鹿茸大剂量的浓度为0.12%，中剂量的浓度为0.08%，小剂量的浓度为0.04%。
 
 
 
 
 
 
 
2002年12月17日      星期二
一、 配制闪烁液
1、 用电子天平称取POPOP 0.2g，PPO 2.0g。
2、 将上二者溶解在500ml二甲苯中，避光保存，备用。
 
2002年12月18日      星期三
一、 3号板加药后48小时加同位素³H TdR及³H脯氨酸
1、 用1ml注射器抽取0.1ml ³H TdR （即0.1μci）(³H TdR及³H脯氨酸购买时浓度为1mci/ml)。
2、 加DMEM**0.5ml，将³H TdR配制成0.2 mci/ml浓度。
3、 同法配制相同数量的³H脯氨酸。
4、 根据试验前设计，按每孔5μl（即1μci）的量加入同位素。
5、 置于37℃、5%CO₂孵箱中培育12小时。
 
2002年12月19日    星期四
一、 MTT染色
1、 用电子天平称量MTT染料0.02g。
2、 用DMEM溶解并稀释**4ml，PH值测定7.2。
3、 用0.22μm滤膜过滤除菌。
4、 根据试验前设计，往1号板与2号板相应的培养孔内，按0.1ml/孔加入MTT染色液。
5、 置于37℃、5%CO₂孵箱中培育5小时。
6、 按二甲基甲酰胺：Triton-X100：水=3：1：2的比例配置42ml脱色液（用柠檬酸调节PH**5～6）。
7、 按每孔1ml将脱色液加**1号及2号培养板相应的培养孔中。
8、 置于37℃、5%CO₂孵箱中培育3小时，期间间歇振荡十分钟，使结晶充分溶解。#p#分页标题#e#
9、 用移液枪在1号板与2号板各孔中抽吸0.2ml溶液按顺序加入96板培养孔中。
10、 选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值。
 
 
二、 固定3号板细胞，测定同位素的量
（一） 配置0.25%胰蛋白酶溶液
1、 用电子天平称取0.25g胰蛋酶，放入烧杯内。
2、 加入少量的D-Hanks液，充分搅拌，使其成糊状。
3、 再加入D-Hanks液**100ml，不停搅拌，直**完全溶解。
（二） 固定细胞
1、 用移液管将3号板（加药后48小时加同位素）各孔的培养液按顺序吸出并置入相应的试管内。
2、 往各孔内加入少量的0.25%胰蛋白酶溶液，并同时吹打细胞，使贴壁细胞消化脱落，消化不少于5分钟，形成细胞悬液，将细胞悬液再依次加入上面的相应试管内。
3、 将真空泵与玻璃纤维滤膜连接。
4、 用滴管依次将试管中的液体吸尽，滴加在玻璃纤维滤膜上，真空抽吸过滤。
5、 用注射器分别依次抽取2ml 5%三氯乙酸（细胞固定）、5ml蒸馏水（洗去多余的同位素）、1ml无水乙醇（细胞脱色），依次加**滤膜，使细胞固定在滤膜上。
6、 待真空泵将滤膜上的液体吸尽后，用镊子将滤膜取下，有序的置于托盘内。
 
三、 同昨日3号板方法，根据试验前设计往4号板各培养孔中加入5μl（1μci）³H TdR或³H脯氨酸，并置于37℃、5%CO₂孵箱中培育12小时。
 
四、甲苯胺蓝染色
1、试剂配制：甲苯胺蓝乙醇液（甲苯胺蓝0.2g溶于30%乙醇100ml中）。
2、根据试验前设计，将行甲苯胺蓝染色的培养孔中的培养液吸去。
3、用PBS漂洗二次。
4、用70%乙醇固定30分钟。
4、 用甲苯胺蓝乙醇液染20分钟。
5、 倒置显微镜下观察并照相。
 
2002年12月20日       星期五
一、 同昨日方法固定4号板细胞。
二、 将固定3号板及4号板细胞的滤膜依次置入对应的装有闪烁液的小塑料瓶内，闪烁液要覆盖滤膜。
三、 用美G产BECKMAN  LS6500  multi-purpose  液闪仪测定各孔细胞³H TdR或³H脯氨酸的掺入值。
 
 
 
 
 
 
[题名]人关节软骨细胞培养法的改良及其特有表型的检测
[外文题名]The modified chondrocyte culture method and inspection of cell's pheno
type
[作者]宋卫东, 刘尚礼, 李卫平, 沈慧勇, 黄东生, 黄建荣
[单位]广东 广州中山大学附属第二医院骨科 510120
[出处]中华实验外科杂志 2003V20N2 147-148
[资助]G家自然科学青年基金资助项目 (30100188)
[关键词]软骨细胞, 培养, 表型
[摘要]目的:探讨简便、易行的人关节软骨细胞体外培养方法。方法:以0.25%胰酶消化软骨块
0.5 h,0.30%胶原酶消化4 h后,将软骨细胞与小片软骨(0.2 mm^3|大小)共同置入预涂多聚赖氨
酸的培养瓶中培养;与传统方法对照,用倒置显微镜、免疫组织化学、电镜、逆转录-聚合酶链
反应(RT-PCR)等方法，检测经7次传代后软骨细胞表型改变相伴随的形态学及分子生物学特征
。结果:改良法培养的细胞活性率可达100%。经多次传代的软骨细胞仍保持原代软骨细胞的表
型特征,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,并可观察到软骨的特有的细胞-胶原
纤维几何构像。而传统法培养的软骨细胞在第7代特有表型出现改变。结论:本改良法是一种较
方便而且有效的培养法。
[参考文献]4
[题名]软骨细胞凋亡与骨关节炎
[作者]向川
[单位]湖北 武汉华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科 430022
[出处]G外医学·免疫学分册 2003V26N2 110-封三
[关键词]软骨细胞, 凋亡, 骨关节炎
[摘要]骨关节炎(OA)是一种老年人常见的关节疾患,近年研究显示,软骨细胞过度凋亡可能在
OA的发病中产生了重要影响。在OA中,软骨细胞凋亡多通过NO途径和Fas途径发生,并且受IL-1
β、TNF-α、IL-8、bcl-2等因素的影响。阐明软骨细胞凋亡在OA的发病机制中的作用,将有助
于OA的防治。
[文献类型]综述